El Gas Portador y el Eluyente en Cromatografía
Cromatografía de Gases
El gas portador (fase móvil) en cromatografía de gases debe ser químicamente inerte (He, N2 y H2) para no interactuar con el analito. Debe estar libre de impurezas como agua u oxígeno para no dañar la columna. Con columnas capilares, el caudal debe estar entre 1 y 25 mL/min, con una presión de entrada de alrededor de 10 psi.
Cromatografía Líquida
Fase Normal
El eluyente (fase móvil) en cromatografía líquida con fase normal es mayoritariamente apolar (pentano, ciclohexano, CCl4, tolueno, CHCl3, THF, dioxano, acetato de etilo, CH3CN, isopropanol, CH3OH, etc.). Los compuestos polares son los más retenidos. El problema es que el gel de sílice de la columna se desactiva con facilidad y las adsorciones son irreversibles.
Fase Inversa
El eluyente en cromatografía líquida con fase inversa es mayoritariamente polar (agua o disoluciones acuosas, y modificadores orgánicos como CH3OH, CH3CN, THF, IPA). Las moléculas apolares, a igualdad de tamaño, son las más retenidas, y a igualdad de polaridad, cuanto mayor es su tamaño, más retenidas quedan.
Desgasificación del Eluyente
Procedimientos
- Desgasificador al vacío: El líquido pasa por un tubo poroso alrededor del cual se aplica vacío, de forma que el gas escapa.
- Desplazamiento con un gas menos soluble (He): Burbujeo de He que se lleva el oxígeno.
- Sonicación
- Calentamiento
- Ultrasonidos
Ley de Henry
Estos procedimientos se basan en la Ley de Henry, que explica que la solubilidad de un gas es función de la presión parcial a la que se encuentra. Disminuir la presión parcial de oxígeno en la fase gas lo desplazará de la fase líquida.
Importancia de la Desgasificación
Es necesario desgasificar los eluyentes para eliminar el aire y reducir el riesgo de formación de burbujas en la columna o el detector. Las burbujas afectan el volumen inyectado y provocan oscilaciones en la señal del detector.
Sistemas de Bombeo de Eluyente
Baja Presión
Los eluyentes se mezclan en una válvula proporcional y luego entran en una bomba de doble pistón.
Alta Presión
Cada eluyente tiene su bomba de doble pistón y luego se mezclan en un mezclador a alta presión.
Bomba de Doble Pistón
Tiene dos pistones en serie que trabajan sincrónicamente, permitiendo un bombeo constante y evitando pulsos de presión. El primero es mayor (el doble) que el segundo, de forma que al vaciarse el pistón grande rellena el pistón pequeño.
Válvula Proporcional
Es una válvula situada antes de la bomba en HPLC que abre los tubos proporcionalmente en función de la composición deseada.
Acetonitrilo vs. Metanol
El acetonitrilo (ACN) es más apolar (mayor poder elutrópico en columnas de fase inversa), menos viscoso y absorbe a menor longitud de onda (longitud de onda cut off menor) que el metanol.
Relación de Split en Cromatografía de Gases
Es la relación entre la cantidad de flujo de gas portador + muestra que sale por el split y lo que se introduce en la columna. Ejemplo: relación de split 60:1 significa que entra 1 mL/min a la columna y salen por el split 60 mL/min.
Diferencia entre Gas Portador y Eluyente
Cromatografía de Gases
La fase móvil (gas portador) es inerte y no interacciona con los analitos. La separación se basa únicamente en la interacción del analito con la fase estacionaria. Un cambio del gas portador no modifica la selectividad del sistema.
Cromatografía Líquida
La fase móvil (eluyente) es un disolvente que interacciona con los analitos. La separación se produce en función de la interacción del analito con la fase estacionaria y la fase móvil. Un cambio de la fase móvil sí modifica la selectividad del sistema.
Disolvente de Muestra con Mayor Poder Elutrópico
Si se disuelve una muestra en un disolvente con mayor poder elutrópico que la fase móvil, la muestra avanzará más rápido mientras esté con el disolvente en la columna. Los picos tendrán una tendencia a salir hacia delante, produciéndose una cola por la parte delantera del pico.
Precisión y Discriminación en la Inyección
HPLC vs. HRGC
La inyección en HPLC es más precisa y menos discriminante que en HRGC. La inyección en HPLC se realiza mediante un mecanismo con un loop que garantiza la reproducibilidad. En HRGC, hay riesgo de pérdidas en el inyector (discriminación) debido a la diferente volatilidad de las sustancias.
Precisión
Se refiere a la similitud entre las áreas de las inyecciones sucesivas, es decir, la repetitividad del método cromatográfico.
Discriminación
Se refiere al efecto de que los compuestos más volátiles entren en mayor cantidad a la columna, mientras que los menos volátiles no se evaporan y se eliminan por el split.
Parámetros Cromatográficos
- Tiempo de retención (tR): Tiempo que tarda un analito en recorrer la columna.
- Tiempo muerto (tm): Tiempo en que salen de la columna las especies no retenidas.
- Tiempo de retención corregido (tR’): tR – tm, indica el tiempo que el analito está retenido en la fase estacionaria.
- Factor de retención o capacidad (k’): Relación entre el tiempo de interacción del analito con la fase estacionaria y la fase móvil.
- Selectividad (α): Estudia la separación entre los picos, relacionando los tiempos de retención.
- Resolución (Rs): Compara la diferencia entre los tiempos de retención de cada pico con la diferencia de la mitad de sus anchuras de base.
- Eficacia (N): Número de platos teóricos, depende del tiempo de retención y la anchura de pico.
- Altura equivalente del plato teórico (HETP, H): Relacionada con la eficacia y la longitud de la columna, define la eficiencia de la columna.