PROCEDIMIENTO DE ENFOQUE CON EL OBJETIVO DE INMERSIÓN
A. Baje totalmente la platina con el aro de enfoque grueso. B. Accione el regulador eléctrico para obtener la máxima intensidad luminosa de la bombilla. C. Suba el condensador (si es posible) para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar. D. Abra del todo el diafragma.
E. Gire el revólver dejándolo a medio camino entre el objetivo de inmersión y el de 40x. F. Coloque el portaobjetos con la preparación en la platina sujetándolo con las pinzas y situando la preparación sobre el círculo de luz. G. Coloque UNA SOLA gota de aceite de inmersión sobre la preparación. H. Termine de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. Debe sentirse en los dedos el ‘clic’. I. Mire directamente al objetivo, suba la platina lentamente hasta que la lente toque la gota de aceite y esté inmersa en ella. En este momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. J. Con los ojos situados en los oculares se procede cuidadosamente a enfocar con el anillo o aro de enfoque fino. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación está en torno a una décima de milímetro, por lo que hay que bajar muy poco a poco hasta observar la preparación con claridad. K. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menos aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. L. Se debe limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica y si fuese necesario con un disolvente, utilizando muy poca cantidad de éste. Hay que tener en cuenta que una vez que se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación ya no se puede usar el objetivo de 40X sobre esta zona, pues semancharía de aceite.
Pasos a seguir en la preparación de una muestra fijada y teñida. I. Obtención del frotis bacteriano (la muestra bacteriana se fija al portaobjetos) que se realiza en tres pasos: Primero. Se realiza una extensión de la muestra. A esta extensión también se le llama frote, frotis o película. Debe ser suficientemente delgada y lo más homogénea posible. Se puede obtener de la forma siguiente: supongamos que tenemos un cultivo bacteriano en un medio sólido (agar) y queremos teñir las bacterias que crecen en una colonia que nos ha llamado la atención. Para ello comenzamos por obtener una extensión de esta colonia. Se pone una gota muy pequeña de suero salino o de agua destilada en un portaobjetos. Se toma con el asa una porción muy pequeña de la colonia, se emulsiona en la gota de líquido y se extiende de modo que ocupe 1 o 2 cm2. Segundo. Se deja secar al aire o agitándola a unos 20-35 cm encima de la llama del mechero Bunsen, de modo que el aire caliente que asciende tenga una temperatura que el operador pueda soportar. No debe calentarse más porque podría estropearse la muestra. Tercero. Se fija la extensión: Se pasa el portaobjetos por la llama del Bunsen dos o tres veces rápidamente. Debe averiguarse si se ha calentado demasiado golpeando el portaobjetos sobre el dorso de la mano y comprobando que no quema. Este tratamiento coagula las proteínas bacterianas y fija las células al vidrio, haciendo menos probable que las bacterias sean arrastradas por los líquidos que se agregan para teñir, siendo este el principal motivo que hace necesaria la fijación. Debe tenerse en cuenta que en la extensión fijada aún pueden quedar gérmenes viables, por lo que debe tratarse como material infeccioso. II. Tinción. Más adelante se describen los procedimientos concretos para cada tipo de tinción. Durante la tinción los microorganismos captan el colorante.
Teñir supone una reacción de intercambio de iones de colorante a lugares activos de la superficie o interior de las estructuras de la célula. Esto permitirá, contrastar mucho más el microorganismo con respecto al medio que le rodea. III. Lavado. Permite eliminar el exceso de colorante. Una vez teñida la extensión, se lava con agua (dejando resbalar un chorro suave aplicado a un extremo del portaobjetos para que no arrastre la extensión teñida). IV. Secado. Permite eliminar el exceso de agua que dificultaría una adecuada observación microscópica. A. Para secar la extensión el portaobjetos puede escurrirse colocándolo de canto sobre papel de filtro. Después se deja secar sobre la mesa o bien se seca rápidamente sobre la columna de aire tibio que despide un Bunsen. B. Otra posibilidad consiste en absorber con un papal absorbente (normalmente papel de filtro) la mayor parte del agua colocando el papel sobre la extensión y presionando ligeramente. Después se termina en el aire caliente del Bunsen. Sin embargo, hay que ser muy cuidadoso con este procedimiento, pues es fácil que la extensión quede adherida al papel absorbente.
OPTIMIZACIÓN DE LA VISIÓN: USO DE DIAFRAGMA Y CONDENSADOR.
Debajo de la platina y por encima de la fuente de luz se encuentran el diafragma y el condensador. El condensador es una lente que concentra el haz de luz haciéndolo converger en la zona centrada del portaobjetos. De este modo aumenta la intensidad de la iluminación. Esto es necesario cuando se trabaja a gran aumento. El condensador se manipula con una palanquita cuya forma y posición puede variar de un fabricante a otro. El diafragma es una membrana de apertura variable similar a los conocidos diafragmas de las cámaras fotográficas. Se utiliza principalmente para observaciones en fresco (sin colorantes). Como la mayoría de los microorganismos tienen índices de refracción similares a los del medio acuoso en el que están suspendidos, resultan difícilmente visibles a menos que ellos o la técnica sufran alguna modificación. La disminución de la apertura del diafragma puede permitir la visualización de varios de los protozoos, hongos y otras entidades microscópicas. Esto se debe a que la luz incidirá sobre los bordes del objeto formando un ángulo más agudo, aumentando así el contraste. Acabamos de decir que el diafragma controla el contraste y el condensador controla la intensidad de la iluminación. Esto es cierto para la mayoría de los microscopios, pero hay que tener en cuenta que en algunos de estos instrumentos, debido a sus carácterísticas constructivas, si se cambia la distancia entre el condensador y la preparación también se puede hacer que cambie el contraste. En algunos microscopios el contraste se controla incluso mejor desde el condensador que desde el diafragma.
Tipos de microscopios:
1. Microscopios ópticos: producen imágenes amplificadas mediante el uso de luz visible (ondas electromagnéticas del espectro visible). Son los más usados en microbiología. Se usan rutinariamente para identificar bacterias, hongos, parásitos y protozoos.
2. Microscopios electrónicos: en lugar de radiación electromagnética utilizan un haz de electrones para obtener la imagen amplificada. Se utilizan
principalmente en investigación (para el estudio de orgánulos intracelulares) y en virología.
Tipos de microscopios ópticos
1. Microscopio de campo claro, también llamado de campo brillante o de campo luminoso. Es el de uso más común. Permiten la observación de preparaciones en su color natural o contrastadas mediante tinciones resaltadas sobre un fondo más brillante
2. Microscopio de campo oscuro. Permiten la observación de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales
3. Microscopio de contraste de fase. Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el índice de refracción de las células y el medio que las rodea, permiten la observación de células vivas, ya que no es necesario realizar ninguna tinción de las mismas.
4. Microscopio de luz ultravioleta.
5. Microscopio de fluorescencia. La fuente de iluminación proporciona luz ultravioleta que excita ciertas moléculas presentes en lascélulas (bien de forma natural o añadidas a la preparación) que emiten fluorescencia de luz visible.
Es necesario puntualizar que los instrumentos de luz UV, fluorescencia o contraste de fase casi siempre tienen integrada la función de microscopía de campo claro. Asimismo, hay instrumentos que pueden desarrollar tres o las cuatro funciones citadas.
Tipos de tinciones según como sean las condiciones de la tinción. Se distinguen dos tipos:
-Tinción en condiciones normales. Sigue la técnica general de tinción realizada a temperatura ambiente: extensión, desecación, fijación, aplicación del
colorante, lavado y secado. La tinción se realiza colocando el portaobjetos con la extensión ya fijada sobre unas barras paralelas colocadas sobre una cubeta o un cristalizador. Se añaden el colorante y otras sustancias. Los residuos se recogen sobre el cristalizador.
-Tinción en condiciones drásticas. Se utiliza cuando los gérmenes no se tiñen en condiciones normales. Se recurre a la tinción con emisión de vapores. Un ejemplo es la tinción de esporas.
Tipos de tinciones según cómo sea la complejidad de la tinción. Podemos distinguir dos tipos:
-Tinción simple: consiste en el teñido de los gérmenes mediante la aplicación de un solo colorante a una extensión fijada. Normalmente la extensión fijada se inunda con la disolución del colorante durante un tiempo determinado, tras lo cual se arrastra con agua el exceso de colorante y el portaobjetos se seca. Por regla general las células se tiñen uniformemente, de modo que este procedimiento es útil para determinar la morfología celular. En un número limitado de casos también es posible observar en el interior de las células gránulos teñidos con mayor intensidad.
-Tinción diferencial: se llama así a los procedimientos de tinción que ponen de manifiesto diferencias entre distintas células, o bien entre las distintas partes de una célula. Estas diferencias pueden observarse gracias no sólo a diferencias de forma sino también de color. Habitualmente implican el uso de más de un colorante en etapas sucesivas.