Detectores Comunes en Cromatografía de Líquidos (HPLC)

1. Describe algunos detectores de uso común en cromatografía de líquidos y sus principios de operación.

En HPLC, se utilizan diversos detectores para identificar y cuantificar los analitos separados. A continuación, se describen cuatro de los más importantes:

• Detector de Arreglo de Diodos (DAD o PDA): Gracias a su rapidez, es capaz de registrar la totalidad del espectro UV-Vis de forma simultánea para cada punto del cromatograma. Esto proporciona un cromatograma tridimensional que muestra la absorbancia en función del tiempo y la longitud de onda, permitiendo la identificación de picos y la evaluación de su pureza.
• Detector de Fluorescencia (FLD): Se basa en la capacidad de ciertos solutos para emitir fluorescencia. Es altamente selectivo y sensible, ya que solo detecta compuestos que son naturalmente fluorescentes o aquellos que pueden serlo tras un tratamiento químico de derivatización.
• Detector de Índice de Refracción (RID): Es un detector universal que mide los cambios en el índice de refracción del eluyente a medida que los analitos pasan a través de la celda de detección. Es ideal para componentes sin cromóforos UV (que no absorben luz UV), como azúcares o polímeros. Sin embargo, no puede emplearse en elución con gradiente, sus mediciones se ven muy afectadas por la temperatura y, en general, no es tan sensible como otros detectores.
• Detector Espectrométrico de Masas (MS): Ofrece una selectividad y sensibilidad excepcionales. Funciona ionizando los compuestos que eluyen de la columna y separando los iones resultantes según su relación masa/carga (m/z). Esto permite no solo detectar, sino también confirmar la identidad estructural de un compuesto. Proporciona una alta selectividad, ya que permite aislar picos no resueltos mediante la monitorización de una masa específica.

Fundamentos de las Fases Cromatográficas

2. ¿Qué es la cromatografía de fase normal y la cromatografía de fase reversa?

• Cromatografía de Fase Normal (NP-HPLC): Se caracteriza por usar una fase estacionaria polar (como sílice) y un eluyente o fase móvil no polar (como hexano). En este sistema, cuanto más polar es el disolvente, más fuerza eluyente tiene, lo que significa que los compuestos polares se retienen fuertemente en la columna y los no polares eluyen primero.
• Cromatografía de Fase Reversa (RP-HPLC): Es la modalidad más utilizada. Emplea una fase estacionaria no polar o débilmente polar (como sílice modificada con cadenas de C18) y un disolvente o fase móvil polar (como una mezcla de agua y metanol o acetonitrilo). En este caso, cuanto menos polar es el disolvente, más fuerza de eluyente tiene. Los compuestos no polares son los que se retienen con más fuerza.

3. ¿Cuál es la forma más común de HPLC y por qué?

La cromatografía de fase reversa es la modalidad más utilizada en HPLC. Esto se debe a su gran versatilidad y a que la mayoría de los compuestos orgánicos de interés son solubles o parcialmente solubles en las fases móviles acuosas que se emplean. Permite la separación de una amplia gama de analitos, desde moléculas pequeñas hasta biomoléculas, simplemente ajustando la polaridad de la fase móvil.

4. ¿Por qué se recubren las partículas de sílice en las columnas de fase reversa?

En la fabricación de fases enlazadas de fase reversa, los grupos silanol (Si-OH) residuales en la superficie de la sílice, que son muy polares, pueden interactuar de forma no deseada con los analitos, causando un ensanchamiento de los picos conocido como «colas» (tailing). Para evitar esto, estos grupos se recubren mediante un proceso llamado «end-capping», haciéndolos reaccionar con un agente como el clorodimetilsilano (por ejemplo, ClSi(CH₃)₃), eliminando así los puntos de adsorción polar y mejorando la forma de los picos.

5. ¿Cuáles son algunas de las fases enlazadas de uso más frecuente?

• Fases no polares para Fase Reversa: Octadecil (C18), Octil (C8) y Fenil.
• Fases polares para Fase Normal: Amino (-NH₂), Ciano (-CN) y Diol (-CH(OH)CH₂(OH)).

Optimización y Componentes del Sistema HPLC

6. ¿Por qué se usa un gradiente de elución en HPLC?

La elución con gradiente se utiliza para mejorar la separación de mezclas complejas que contienen compuestos con una amplia gama de polaridades. Consiste en un cambio continuo de la composición del eluyente durante el análisis, aumentando progresivamente su fuerza eluyente. Esto es análogo a la programación de temperatura en cromatografía de gases. Permite eluir solutos débilmente retenidos al principio y, posteriormente, eluir solutos fuertemente retenidos en un tiempo razonable y con una buena forma de pico.

7. Diferencias entre partículas microporosas, perfusivas y no porosas.

• Partículas Microporosas: Son las más comunes. Se trata de esferas de sílice muy pura, permeables al disolvente, cuya área superficial se encuentra mayoritariamente dentro de los poros. Proporcionan una alta capacidad de carga y eficiencia.
• Partículas Perfusivas: Están formadas por una mezcla de poros grandes (pasantes) y poros pequeños (difusivos). Esta estructura permite que parte de la fase móvil fluya a través de la partícula, mejorando la transferencia de masa y permitiendo separaciones rápidas, especialmente de moléculas grandes como las proteínas.
• Partículas no Porosas: Tienen tamaños de partícula mucho menores (1.5 a 2.5 µm) y una capa porosa muy delgada en su superficie o son completamente sólidas. Eliminan la fase móvil estancada dentro de los poros, lo que permite una transferencia de masa extremadamente rápida y análisis de alta velocidad, aunque con una menor capacidad de carga.

8. ¿Qué es una precolumna y para qué se usa?

Una precolumna (o columna de guarda) es una columna pequeña que se coloca delante de la columna analítica principal. Su función es proteger la columna analítica, que es mucho más costosa. Sirve para retener partículas y contaminantes químicos presentes en la muestra o los disolventes, prolongando así la vida útil y el rendimiento de la columna analítica. En la cromatografía de líquido-líquido, también sirve para saturar la fase móvil con la fase estacionaria, minimizando las pérdidas de esta última en la columna principal.

Resolución de Problemas y Preparación de la Fase Móvil

9. ¿Cuáles serían los principales problemas que se podrían presentar en HPLC y cómo los resolverías?

A continuación, se describen tres problemas comunes y sus posibles soluciones:

1. Sobrepresión del sistema:
   • Causa: Bloqueo en alguna parte del sistema, comúnmente en la frita de entrada de la columna o en la propia columna.
   • Solución: Realizar un retrolavado (backflush) de la columna con un disolvente fuerte (siguiendo las recomendaciones del fabricante). Si la presión no disminuye, limpiar o reemplazar la frita de entrada. Asegurarse de que la muestra y la fase móvil estén siempre filtradas.
2. Malas formas de pico (picos anchos o con colas):
   • Causa: Contaminación de la columna, interacciones secundarias no deseadas (ej. con silanoles libres), volumen muerto excesivo en el sistema o un pH inadecuado de la fase móvil.
   • Solución: Lavar la columna con una secuencia de disolventes fuertes para eliminar la contaminación. Ajustar el pH de la fase móvil para asegurar que los analitos estén en su forma neutra. Revisar todas las conexiones para minimizar el volumen muerto.
3. Cambio en los tiempos de retención o pérdida de resolución:
   • Causa: Cambios en la composición de la fase móvil, degradación de la columna, fluctuaciones de temperatura o problemas con la bomba (flujo inestable).
   • Solución: Preparar fase móvil fresca y desgasificarla adecuadamente. Verificar la precisión y estabilidad del flujo de la bomba. Utilizar un termostato para la columna para mantener una temperatura constante. Si la columna está degradada, puede ser necesario reemplazarla.

10. Explica paso a paso qué se requiere para la preparación de la fase móvil empleada para HPLC.

La preparación adecuada de la fase móvil es crucial para obtener resultados reproducibles y estables. Los pasos son los siguientes:

1. Selección de Disolventes: Utilizar siempre disolventes de alta pureza (grado HPLC). La fase móvil puede ser un disolvente único (isocrática) o una mezcla de varios (gradiente).
2. Medición y Mezcla: Medir con precisión los volúmenes de cada disolvente si se trata de una mezcla. Es fundamental ser consistente en la preparación para garantizar la reproducibilidad de los tiempos de retención.
3. Filtrado: Filtrar la fase móvil a través de una membrana de poro pequeño (típicamente 0.45 µm o 0.22 µm) para eliminar cualquier partícula en suspensión. Esto previene el bloqueo de las fritas, válvulas y la columna.
4. Desgasificación: Eliminar los gases disueltos (como O₂ y N₂) de la fase móvil. Los gases pueden formar burbujas en el sistema de bombeo o en el detector, causando flujos inestables y ruido en la línea base. Los métodos comunes incluyen la sonicación en un baño de ultrasonidos, el burbujeo con helio o la desgasificación en línea mediante vacío.
5. Almacenamiento: Guardar la fase móvil en recipientes limpios y tapados para evitar la contaminación por partículas o la evaporación selectiva de los componentes más volátiles.