Sistemas de entrada y fuentes de ionización en espectrometría de masas

Sistemas de entrada

• Sistemas de entrada por sonda directa: Permiten introducir líquidos y sólidos volátiles en pequeñas cantidades (incluso poco volátiles o termolábiles).
• Sistemas de entrada por ablación láser: Se utiliza para sublimar muestras sólidas que son difíciles de digerir químicamente: cerámicas, vidrios y sustancias resistentes a ácidos. El láser pulsado calienta la superficie y desprende parte de la muestra. El material eliminado en forma de pequeñas partículas se conduce a la fuente de iones del espectrómetro de masas mediante el flujo de un gas inerte.
• Sistemas de entrada continua de muestra:
  • Infusión
  • Inyección directa en flujo
  • Inyección directa por separación

Fuentes de ionización

En la fuente de iones se crean o desorben iones. El aspecto de un espectro de masas depende en gran medida del método utilizado para la formación de los iones. Las fuentes de iones pueden ser duras o blandas:

• Fuentes duras: comunican energías elevadas a los iones formados, produciendo una gran fragmentación de los mismos. Resultado: espectros complejos con gran información estructural.
• Fuentes blandas: comunican bajas energías a los iones formados, produciendo muy poca o nula fragmentación. Resultado: espectros sencillos que permiten determinar la fórmula molecular.

La elección de la fuente de iones dependerá de la naturaleza de las moléculas analizadas: masa molecular, polaridad, solubilidad, volatilidad y estabilidad térmica.

1. Fuentes de fase gaseosa

El proceso de ionización se realiza sobre una muestra previamente evaporada.

• Moléculas volátiles: térmicamente estables a T < 500 °C → moléculas apolares con pesos moleculares < 500 Da.
• Duras: EI (ionización por impacto electrónico).
• Blandas: CI (ionización química) y APcI (ionización química a presión atmosférica).

2. Fuentes de desorción

El proceso de ionización se realiza directamente sobre una muestra sólida o líquida, prescindiendo de su vaporización previa.

• Moléculas no volátiles y termolábiles: moléculas con cierta polaridad con pesos moleculares hasta < 500 kDa; biomoléculas (especies bioquímicas delicadas).
• Muy blandas: MALDI y ESI.

Ionización por impacto electrónico (EI)

EI (baja presión; alta energía) — suele observarse el ion molecular (M+•).

• Primera fuente de ionización descrita para espectrometría de masas (1919).
• El bombardeo de moléculas neutras gaseosas con electrones (procedentes de filamentos incandescentes y acelerados entre electrodos) a energías del orden de los 70 eV produce iones moleculares.
• La colisión entre los electrones energéticos y las moléculas del analito proporciona a estas suficiente energía interna residual para dejarlas en estados vibracionales y rotacionales excitados, lo que produce fragmentación.

Ionización química (CI)

CI (alta presión; baja energía) — suele observarse el ion tipo (MH+).

• La Ionización Química (introducida en 1965) tiene lugar por colisión de las moléculas neutras gaseosas de la muestra con iones de un gas reactivo. El gas reactivo actúa como mediador para suavizar las condiciones de ionización de la muestra.
• Se introduce el gas reactivo en la cámara de ionización a unos 10^-3 torr. Su presión es mayor que la de la muestra.
• La ionización inicial del gas reactivo se origina por impacto electrónico, produciendo iones cuasimoleculares.

Nota: el analizador está en el vacío; para mantener la diferencia de potencial se utiliza una bomba de alto vacío para evacuar la región entre la fuente de ionización y el analizador de masas.

Reacciones con gas reactivo (ejemplo con CH4)

Reacciones elementales (ejemplos):

• CH4 + e- → CH4+• + 2 e-
• CH4+• + CH4 → CH5+ + CH3•
• CH4+• → CH3+ + H•
• CH3+ + CH4 → C2H5+ + H2

Reacciones químicas con el analito (M):

• CH5+ + M → CH4 + MH+
• C2H5+ + M → M(C2H5)+
• CH4+• + M → CH4 + M+•
• C2H5+ + MH → C2H6 + (M-H)+

Ionización química a presión atmosférica (APcI)

APcI — iones tipo [M+H]+ o (M-H)-

• Los iones gaseosos se forman a partir de reacciones químicas en fase gaseosa entre las moléculas neutras del analito y iones reactivos procedentes del disolvente.
• Se inyecta el líquido que pasa por un nebulizador en el que se utiliza N2 y se forma un aerosol. Mediante una descarga y un electrodo se producen iones reactivos cargados (a 3–5 kV) que transfieren la carga al analito, formándose iones de analito.

Reacciones (ejemplos con metanol):

• MeOH + e- → [MeOH]+ + 2 e-
• [MeOH]+ + MeOH → [MeOH2]+ + MeO-

Ionización por desorción con láser asistida por matriz (MALDI)

MALDI — técnica muy útil para macromoléculas.

La gran utilidad de MALDI (desarrollada en 1987) es su capacidad para analizar macromoléculas de unos pocos miles (péptidos) a cientos de miles de daltons (proteínas).

1. La muestra se dispersa en una matriz (relaciones típicas 10⁴–10⁷:1) con la ayuda de un disolvente adecuado y se coloca en una placa. Se deja secar y, una vez evaporado el disolvente, se produce la cocristalización del analito con la matriz. La función de la matriz es:
   • Aislar las moléculas de analito entre sí y rodearlas de un gran número de moléculas de matriz.
   • Absorber gran parte de la energía del láser evitando que se degraden las moléculas de analito.
   • Actuar como dador o receptor de protones durante la ionización del analito.
2. El disolvente utilizado debe solubilizar tanto la matriz como la muestra y permitir la cocristalización de la matriz con el analito de forma homogénea.
3. La ionización se produce por la energía de un pulso láser (IR o UV) que ioniza la matriz y transmite la carga al analito, provocando la desorción de la matriz y arrastrando consigo al analito. El punto caliente debe ser de muy corta duración para evitar la descomposición térmica. La longitud de onda del láser debe ser adecuada para conseguir la excitación electrónica (láser UV) o vibracional (láser IR) de la matriz.

Ionización por electronebulización (ESI)

“Ionización en fase líquida”

La electronebulización (ESI) expulsa hacia la fase gaseosa iones preexistentes en disolución, pero no crea nuevos iones. El control del pH ayuda a que las especies ionizables se encuentren en su forma aniónica o catiónica. Asimismo, especies neutras polares pueden protonarse o asociarse a iones presentes en la fase móvil, y especies neutras menos polares pueden sufrir reacciones de oxidación/reducción a la salida del capilar de la sonda.

Principio operativo (esquema):

• Una disolución fluye a través de una aguja hueca sometida a un campo eléctrico de 5–10 kV/cm; se forman gotas pequeñas cargadas eléctricamente.
• La aguja puede tener flujos concéntricos: el flujo interior lleva la muestra; el exterior es un segundo líquido que se mezcla con la muestra y puede modificar el contenido iónico y mejorar el contacto eléctrico con el metal. En algunos diseños hay un tercer fluido, generalmente un gas portador que ayuda a la formación de gotas.
• Las gotas (≈ 1 μm de diámetro) tienen carga neta y son atraídas a un electrodo a través de un volumen abierto. Las gotas se mueven en contracorriente con un flujo que evapora parte del disolvente (desolvación). Como consecuencia, los iones en la superficie quedan más concentrados; en cierto momento la repulsión entre cargas supera la tensión superficial y las gotas se rompen (límite de Rayleigh). El proceso completo puede denominarse evaporación de iones o desolvación y formación de iones.

Fuentes API complementarias

ESI

• Técnica de ionización muy suave, ideal para compuestos termolabiles.
• Indicada para compuestos con cierta polaridad (de baja-media a muy alta polaridad) que se puedan ionizar en disolución.
• Interfase con mayor sensibilidad y amplia aplicabilidad (más del 90%).
• La formación de iones con múltiples cargas permite el análisis de compuestos de muy elevado peso molecular.

APcI

• Requiere compuestos con una cierta volatilidad (no termolábiles).
• Indicada para compuestos de baja a media polaridad.
• No se requiere que los analitos estén ionizados en disolución.
• Buena sensibilidad para compuestos de polaridad y peso molecular intermedios.
• Complementaria a ESI para el análisis de compuestos poco polares.

ESI vs. APcI: factores que afectan a la señal del analito

• Concentración del analito
  • ESI: la señal puede saturarse (≈ 10 μM).
  • APcI: no se observa el mismo efecto de saturación.
• Matriz
  • ESI: la señal disminuye con el aumento de la concentración de otros electrolitos (efecto de «supresión iónica»).
  • APcI: no hay efectos importantes de supresión iónica en muchos casos.
• Flujo de fase móvil
  • ESI: la respuesta disminuye con el aumento del flujo; flujos óptimos: 0.1–0.2 mL/min.
  • APcI: necesita flujos más altos (0.5–1 mL/min).

Formación de aductos

• ESI+: habitualmente forman aductos con Na+ (M+23), K+ (M+39) o NH4+ (M+18).
• APcI+: se pueden formar aductos con NH4+, pero no con Na+ o K+ en condiciones típicas.
• ESI/APcI: es posible la formación de aductos con un anión procedente del eluyente: HCOO-, CH3COO-, Cl-, …

Formación de clústeres

• ESI+: es posible la formación de aductos con disolvente: [MH+CH3CN]+, [MNa+CH3CN]+, [MH+CH3OH]+, [MH+H2O]+, …